اصلاح برنج به روش كشت بساك

تك لادها Haploids اسپروفيت هايي با تعداد كروموزوم هاي گامتوفيتي هستند. آن ها با استفاده از كشت گامتوفيت هاي نر يا ماده در محيط هاي غذايي مي توانند به وجود آيند. كشت بساك برنج براي توليد تك لادها به عنوان يك ابزار زادشناختي و اصلاح نژادي نيرومندي و به طور كلي در اصلاح گياهان زراعي، جالب ترين پديده اي است كه در آزمايشگاه ابداع شده است. به ويژه هنگامي كه اين روش همراه با روش هاي ديگر اصلاح نژاد براي بروز نشانويژگي هاي مناسب در گياهان زراعي به كار رود از اهميت خاصي برخوردار خواهد گرديد. اولين بار ني اي زيكي و اونو (1968) در ژاپن از كشت بساك برنج مفق به توليد گياه تك لاد شدند. ني اي زيكي و هير نيز بعدا از مدت كوتاهي گزارش دادند كه گياهان تك لاد به دليل اين كه از دوبرابر شدن كروموزوم هايشان گياهان دولاد Diploids و جور تخم Homozygous حاصل مي شود، براي دانشمندان علم ژنتيك و اصلاح نبات اهميت ويژه اي يافته است.

برنج اولين گياه تك لپه اي است كه از كشت بساك آن گياه تك لپه اي توليد شده است. به هر حال پيش از آن كشت بساك گياهان دو لپه‌اي نظير تاتوره و توتون تحقق يافته بود. با اين كه، كشت بساك برنج در سال 1968 گزارش شد، اما تا نزديك ده سال فعاليت چشمگيري وقوع نيافت تا اين كه در سال 1977 با ابداع ماهرانه محيط غذايي N6 توسط چو و ديگر دانشمندان چيني فعاليت‌هاي جديدي آغاز شد. از گزارش‌ها مي‌توان چنين استنباط كرد كه با گذشت 22 سال از آن، تحولات مهم و كوشش‌هاي توقف ناپذيري در كشت بافت برنج به ويژه كشت بساك آن ادامه دارد، اما هنوز به بسياري از پرسش‌هاي آن پاسخ داده نشده است. اين كه چرا زير گونه هندي نسبت به ژاپني داراي قابليت پنبه‌زايي و باززايي كمتري است؟ در مطالعات پيش دش ها protoplasts از قبيل تهيه پيش دش و همجوشي آن و انتقال ژن و DNA چرا زيرگونه هندي Indica نسبت به ژاپني Japonica از بازدهي اندك‌تري برخوردار است؟

توليد يك لاين خالص برنج به روش مرسوم پديگري به 10- 8 سال وقت نيازدارد و اين روند، ازتلاقي والدين شروع مي‌شود. نسل اول (F1) كاملا ناجور تخم اما از نظر زاد شناختي يكنواخت است. از تكثير جنسي گياهان نسل اول تفرق صفات شروع مي‌شود. تفرق صفات عبارت است از جداسازي ژن‌ها و كروموزوم‌هاي همساخت از والدين مختلف در مرحله ميوزي. در نسل دوم (F2) حداكثر تفرق صفات بروز مي‌ يابد و در نسل پنجم (F5) گياهان با 97% جور تخمي حاصل مي‌شود. در حالي كه براي گياهان جور تخم از طريق كشت بساك تنها چند ماه زمان كافي است. از دو برابر كردن كروموزوم‌هاي گياهان تك لاد، گياهاني به دست مي‌ايد كه به طور كامل جور تخم هستند و خالص مي‌باشند (گامبورگ 1986)

اهداف

كشت بساك و ريزهاگ Microspore يكي از راه‌هاي دستيابي به گياهان تك لاد است كه به طور وسيعي در اصلاح گياهان زراعي به كار برده مي شود. برتري و مزيت توليد تك لاد‌ها در برنج به منظور كوتاه كردن دوره اصلاح با پايداري جور تخمي، افزايش كارايي انتخاب، تغيير‌پذيري وسيع زاد شناختي از راه ايجاد متغيير‌هاي گامتوكلني و پيگيري بروز سريع ژن‌هاي نهفته (مغلوب) هدف اساسي اين گياهان بسيار با اهميت را تشكيل مي‌دهد. از كشت بساك دو رگ‌هاي F1 در مدت زمان كوتاه‌تري مي‌توان به ارقام خالص و پايدار دست‌يافت و به اين ترتيب نيروي كار، زمان و فضاي لازم و امكانات موجود را براي توليد لاين‌هاي خالص و پايدار و تثبيت يافته‌اي در مقايسه با روش‌هاي ديگر اصلاح نژاد مي‌توان صرفه جويي كرد. علاوه براين از كشت بافت مي توان در توليد سه لاين برنامه برنج دورگه استفاده كرد و نيز براي خالص سازي ارقام محلي كه در اثر زراعت در مدت زمان طولاني ناخالص گرديده‌اند،سود برد.

عوامل مؤثر در بازدهي كشت بساك برنج

بازدهي كشت بساك و زيرهاگ براي توليد تك‌لاد‌ها به طور قابل ملاحظه‌اي متفاوت است و تاكنون سه عامل مؤثر: منابع گياهي، تيمار فيزيكي و محيط غذايي به خوبي شناخته شده‌اند.

1- منابع گياهي

در برنج پينه زايي و باززايي از بساك و ريزهاگ به زادمون (Genotype) بستگي دارد و از ويژگي‌هاي وراثتي محسوب مي گردد كه توسط يك بسته منفردي از ژن‌ها هدايت مي شود. عموماً برنج‌هاي زيرگونه هندي و دورگهايشان نسبت به ژاپني با پينه زايي و باززايي گياهي كمتر و زالي (Albino) زيادتر مشخص مي شود. به نظر مي رسد فراواني بازدهي كشت بساك و ريزهاگ برنج‌هاي ژاپني مربوط به بزرگي دانه‌هاي گرده شان باشد كه به زادمون و شرايط محيطي رشد گياهان بستگي دارد. نسل اول تلاقي زادمون‌هاي حاصل از تلاقي‌هاي هندي×هندي، هندي× ژاپني و ژاپني× ژاپني نسبت به والدينشان داراي توانايي پينه زايي، باززايي و توليد گياهان سبز و زال متفاوتي هستند. تايچونگ و لاين 304 كه داراي قابليت پينه زايي و باززايي فراوان و سالاري كم بود، اما تلاقي نسل اول هر دو آن‌ها با سالاري متوسط گرديد. در بسياري از موارد دو رگه‌هاي نسل اول نسبت به والدينشان القاي پينه و باززايي بيشتر و توليد گياهان زال فراوان‌تري را حايزاند. اخيراً نظراتي وجود دارد كه نشان مي دهد، القاي پينه و باززايي توسط ژن‌هايي هدايت مي شود كه سيتوپلاسم فاقد آن‌ها است به هر حال عوامل سيتوپلاسمي را در فراواني القاي كشت بساك نمي توان بي تاثير دانست.

شرايط رشد و حالت تنكار شناختي گياه مادري به خوبي رابطه عوامل محيطي و زادشناختي در پاسخ بساك به كشت آزمايشگاهي آن تاثير دارد. درجه حرات مرحله تشكيل جوانه زايشي بستگي به رقم و زادمون دارد، اما آنچه به نظر مي رسد اين است كه در گلخانه در درجه حرارت زياد خوشه‌هايي تشكيل مي‌شود كه با كاهش پينه‌زايي و باززايي و افزايش نسبت زالي‌ها مواجه خواهد گرديد. فصل رويشي، دروه نوري، شدت نور، درجه حرارت محيط، رژيم‌هاي غذايي خاك نيز در بازدهي كشت بساك مؤثرند. لازم به توضيح است كه در توتون بازده زياد گياهان هنگامي حاصل مي شود كه بساك‌ها در مرحله آغاز تكوين جوانه‌هاي گل جمع‌آوري شوند و در ضمن بالاترين سطح جنين‌زايي وقتي مشاهده مي گردد كه منابع گياهي تحت شرايط روز كوتاه و با شدت نور زياد رشد يابد.

مرحله تكوين ريزهاگ‌ها تاثير وسيعي در پينه‌زايي دارد و بساك‌ها يا ريز‌هاگ‌هاي مرحله اواسط تا اواخر تك هسته‌اي مناسب‌ترين وضعيت را در كشت دارند. گرده برنج در مرحله نارس يا به طور كاملاًً رسيده پاسخ اندكي به كشت نشان مي‌دهد. يا حتي پينه زايي ممكن است صورت نگيرد. مرحله‌اي كه بساك‌ها بايستي تحريك شوند و سرمادهي در آن اجرا گردد، به طور مشخصي از زادموني تبعيت مي‌كند. تعداد 3 تا 4 شاخه اصلي هر بوته گياه با فاصله 9- 5 سانتي‌متر برگ پرچم از برگ ما قبل آن تقريباً انتخاب صحيح مرحله تكويني گرده را نشان مي دهد. اما اين فاصله در زادمون‌هاي گوناگون متغير مي‌باشد و علاوه بر تفاوت زاد شناختي نسبت به حالت‌هاي تنكار شناختي گياهان مادري نيز بستگي دارد كه اين فاصله نيز به نوبه خود تحت تأثير عواملي نظير طول روز، شدت نور، درجه حرارت محيط رشد و مواد غذايي خاك و زمان كشت قرارمي گيرد.

براي بازدهي بيشتر پينه زايي و باززايي گياهچه، از شاخه‌هاي قوي عاري از بيماري و آفات كه هيچ گونه كمبود مواد غذايي نداشته باشند، استفاده مي‌شود. ابتدا بذر‌هاي F1 يا ارقام مختلف را در صورتي كه تازه برداشت شده يا محلي ايراني باشد، مدت 5- 3 روز در آون C° 50 قرار مي‌دهند تا دوره خواب آن‌ها شكسته شود. سپس آن‌ها را روي كاغذ صافي مرطوب داخل پتريديش مي‌ريزند و در دستگاه جوانه زني (ژرميناتور) سبز مي كنند.پس از اين كه ريشه‌هاي بذور به اندازه يك سانتي متر رشد كرد، آن‌ها را به خاك جعبه كاشت در گلخانه يا فيتوترون انتقال مي دهند و خاك آن را با آب كافي مرطوب مي سازند. دوره نوري دستگاه فيتوترون 14 ساعت روشنايي با C° 29 و 10 ساعت تاريكي با C° 21 و رطوبت روي 80 الي 85 درصد تنظيم مي شود. هنگامي كه نشاءها به اندازه كافي رشد كردند، آن‌ها را به گلدان‌هاي محتوي خاك مرغوب مزرعه منتقل مي سازند. از آنجا كه گياهان كاشته شده در مزرعه به كشت بساك بهتر پاسخ مي‌دهند، در صورتي كه شرايط آب و هوايي مناسب باشد، بايستي آن‌ها را به خاك مزرعه انتقال داد. گياهاني كه در گلخانه پرورش مي يابند، قدرت القاي پينه بساك و باززايي آن‌ها بسيار اندك است و در نتايج كار تحقيقاتي اثر نامطلوبي بر جاي مي گذارد. در مدت زمان رشد آن‌ها در داخل گلدان و در گلخانه، هيچ وقت نبايد آب زير بوته‌ها كم باشد. اگر گياهان رشد خوبي نداشته باشند، بايستي مقادير 2 گرم اوره ، 5/1 گرم فسفات آمونيوم و 75/1 گرم سولفات پتاسيم از انواع كودهاي مورد استفاده در كشاورزي را به هر گلدان اضافه كرد.

2- تيمارهاي فيزيكي

عوامل فيزيكي داراي دامنه تأثير وسيعي در كشت بساك برنج است و شامل تيمارهاي پيش از كشت و پس از كشت آن مي باشد.

1-2-تيمارهاي پيش از كشت

درصورتي كه خوشه‌ها در معرض تيمارهاي سرمايي يا گرمايي قرار گيرند، بساك هايشان در پينه زايي و باززايي، بازدهي خوبي از خود نشان خواهند داد. مدت زمان و درجه حرارت بهينه براي اين تكانه حرارتي يك ويژگي زادشناختي است. تفاوت زيرگونه‌هاي برنج هندي و ژاپني در نياز به تيمار سرمايي هم به زادمون و هم به حالت تنكار شناختي آن‌ها بستگي دارد. در برنج تيمار سرمايي 8 درجه سانتي‌گراد به مدت 10- 8 روز، پينه زايي و توليد گياهان تك لاد را به طور قابل ملاحظه‌اي افزايش داده است. مدت زمان بيش از 10- 8 روز تأثير معكوسي در پينه زايي دارد. سرمادهي، تباهي دانه گرده نارس و بافت‌هاي ديواره بساك را به تأخير مي‌اندازد و نقش بسيار با اهميتي در پينه زايي بساك برنج دارد. سرمادهي هم زماني و زيستايي ريزهاگ‌ها را تشديد مي‌نمايد و آنزيم‌هايي را فعال مي كند كه در توليد پينه نقش ضروري را بازي مي كنند تا به جنين تكوين يابند. مدت زمان بهينه پيش تيمار سرما با درجه حرارت آن (°C9-7) و مرحله تكوين ريزهاگ‌ها تغيير مي كند. همانطور كه توضيح داده شد، در برنج بالاترين فراواني پينه از بساك هنگامي حاصل مي شود كه خوشه‌هاي قطع شده به مدت 10-8 روز در°C 8 تيمار شوند. علاوه بر اين، گرمادهي خوشه‌ها به مدت 15-5 دقيقه در°C 35 پيش از تيمار سرما در يك رقم برنج به نام 42IR موجب افزايش بازدهي تشكيل پينه شده است (زاپاتا و توريزو، 1986). تكانه‌هاي سرمايي و گرمايي علاوه بر ايجاد همزماني و زيستايي، آنزيم‌هايي ضروري براي القاي پينه ريزهاگ‌ها به جاي عمل زايشي، رشد و نمو اندام سبز را فعال مي كند. اين عمل مي تواند موجب مخفي ماندن ژن‌ها يا فرآورده‌هاي آن‌ها يعني آنزيم‌هايي شود كه عهده‌دار نموگامتوفيتي اند تا ريزهاگ‌ها بتوانند در جهت نمو اسپوروفيتي تغيير يابند.

2-2- تيمارهاي پس از كشت

نگهداري كشت‌ها به منظور پينه زايي و باززايي در درجه حرارت و دوره نوري معين بسيار با اهميت مي باشد، به طوري كه با اندك تغييري در آن نتايج نامطلوبي حاصل مي گردد. بنابراين دسترسي به اتاقك‌هاي درجه حرارت ثابت با دوره نوري و شدت نور قابل تنظيم از ضروريات حتمي است. بهترين درجه حرارت براي براي تشكيل پينه از بساك برنج 1±25 درجه سانتي گراد و براي نمايز يابي و تشكيل گياه از پينه بساك 1±24 درجه سانتي گراد با دوره نوري 8 ساعت تاريكي و 16 ساعت روشنايي ( با شدت نوري 3500 لوكس ) است. درجه حرارت هاي بالاتر از آن ميزان توليد گياهان زال را افزايش و سبز را كاهش مي دهد. به ويژه در درجه حرارت هاي بالاتر از 30 درجه سانتي گراد ميزان توليد گياهان زال به مقدار قابل توجهي زياد مي شود. ازاين گذشته، تراكم بساك ها و نيز طرز قرار گرفتن آن ها در محيط غذايي پينه زا، در بازدهي كشت تأثير بسزايي دارد. علاوه براين، سن پينه در باززايي آن اثر مي گذارد. از انتقال پينه هايي كه 10 روز از تشكيل آن ها مي گذشت به محيط هاي غذايي باززايي تقريبا 50 درصد آن ها گياهچه را توليد كردند. هنگامي كه پينه هاي با سنّ 60 روزه به محيط هاي باززايي انتقال يافتند، همه گياهچه هاي حاصل زال بودند و هيچ گونه گياه سبزي به دست نيامد. به هرحال، پينه هاي مسن تر يا جوان تر و كوچك تر يا بزرگ تر، باززايي گياهان را به اندازه قابل توجهي كاهش و پيدايش گياهان زال را افزايش مي دهد.

3 - محيط غذايي

محيط غذايي در توليد گياهان تك لاد از راه كشت بساك و ريزهاگ اثر مهم و قاطعي دارد. نيازهاي غذايي كشت با زادمون و احتمالا مرحله تكويني بساك و شرايطي كه تحت آن گياهان مادري رشد مي كنند، متفاوت است و اغلب گياهان در يك محيط غذايي كامل ( نمك هاي معدني، ويتامين ها و ساكارز) با مقادير مختلف مواد تنظيم كننده رشد( هورمون ها) يا فاقد هورمون نر زايي دارند. با توجه به اين كه پيشرفت در در توليد گياهان تك لاد تابعي از بازدهي كشت آن است، بهبود محيط هاي غذايي كشت همواره مورد نظر محققان بوده است.

ني اي زيكي و اونو (1968 ) براي اولين بار از كشت بساك برنج گياه تك لاد را به وجود آوردند. آن ها در همان سال در مجله رسمي وزارت كشاورزي ژاپن ( جلد 3 شماره 3 سال 1968 ) اين ر.يداد مهم را ثبت كردند. اما اين روش به دليل عدم وجود شرايط لازم به ويژه محيط غذايي مناسب نتوانست كارايي زيادي داشته باشد و استفاده از آن در اصلاح نژاد برنج عملا متوقف ماند. آن ها از يك محيط غذايي ساده اي استفاده كرده بودند كه با محيط هاي غذايي تكامل يافته امروزي كوچك ترين شباهتي نداشت. چو و همكاران ( 1977 ) محيط غذايي N6 را كه داراي بازدهي پينه زايي بيشتري است، در كشت بساك برنج و غلات ديگر رواج دادند و از اين تاريخ عملاً توليد تك لادها براي اصلاح اين غله مهم اقتصادي آغاز شد. علاوه بر اين، چو (1978) يك محيط غذايي ساده محتوي 20درصد عصاره سيب زميني را براي كشت بساك برنج پيشنهاد كرد. محيط غذايي سيب زميني نسبت به MS نتيجه بهتري داشت. به هر حال كاربرد سيب زميني به نوع و حالت تنكارشناختي آن نيز بستگي دارد. در حال حاضر، براي توليد پينه از بساك برنج، محيط هاي غذايي متعددي مورد استفاده قرار مي گيرد كه مهم ترين آن ها عبارتند از: Fj, L8, Ls, E10, B5, N6 و به ندرت MS . در ميان اين محيط هاي غذايي N6 رايج ترين كاربرد و به ويژه در كشت بساك برنج ارقام زيرگونه ژاپني تأثير بيش تري را نشان داده است. پينه زايي ارقام ايراني نظير عنبربو، حسني و سياه ريحاني كه داراي قابليت پينه زايي بسيار آلي هستند و تلاقي هاي آن ها با ارقام فاقد توانايي پينه زايي نظير خزر، سپيدرود، نعمت و غريب در محيط هاي غذايي N6, L8, Fj نتايج رضايتبخش متفاوتي را نشان دادند. در رقم ايراني عنبربو كه داراي قابليت پينه زايي بسيار عالي مي باشد، در تلاقي با ارقام ديگر ايراني كه فاقد توانايي پينه زايي، نتنها توانايي پينه زايي را در آن ها بالا برد بلكه ميزان توليد گياهان باززايي را نيز به اندازه كافي افزايش داد ( 1377 ). به هر حال، بازدهي اندك كشت بساك برنج زيرگونه هندي در محيط هاي غذايي Fj, L8, N6 همواره يك مشكل بسيار مهمي بوده است. N6 در القاء پينه از خوشه هاي نارس برنج نيز تأثير دارد و با تغيير هورمون هاي آن، در تمايز يابي نيز مورد استفاده قرار مي گيرد.

منابع نيتروژن معدني مانند NO3 و NH4 و مواد آلي مانند: گلوتامين، اسيد گلوتاميك، آلانين، كازئين هيدروليزات، گلوتاتيون و آسپاراژين از مهم ترين نشانويژگي هاي محيط هاي كشت بساك برنج هستند. يون آمونيوم در القاء پينه از دانه گرده نارس بسيار حساس و با اهميت است، به طوري كه مقادير پايين آن پينه زايي را افزايش، اما مقادير زيادتر، آن را متوقف مي سازد. به همين جهت نسبت نيتروژن نيتراتي به آمونيومي در محيط هاي غذايي Fj, MS, Ls, B5, N6 با دقت خاصّي تنظيم يافته كه كارايي آن را در سطح وسيعي موجب شده است. از تغيير اين محيط هاي غذايي، محيط هاي ديگري فراهم گرديده اند كه عبارتند از: He3 از N6 توسط هانگ در سال 1981 و E10 از B5 توسط زاپاتا و توريزو در سال 1985. استفاده از مقادير نيتروژن نيتراتي بيش تر از آمونيومي آن توصيه شده است. اما وقتي نيترات با تركيب غير آمونيومي در محيط هاي غذايي استفاده شود، به مرورزمان pH محيط غذايي بالا خواهد رفت و جذب مواد غذايي ديگر به ويژه يون Fe اختلال ايجاد مي شود.

منابع كربن در محيط غذايي هم انرژي لازم را تأمين مي كند و هم پتانسيل اسمزي را افزايش مي دهد. بافت هايي كه در محيط كشت به تدريج بزرگ مي شوند و در محيط هاي مصنوعي و غير طبيعي رشد كرده اند، نسبت به كربن خود غذا ( اتوتروف ) نيستند بلكه بايستي كربن مورد نياز خود را از يك منبع خارجي جذب كنند. ساكارز يك منبع مؤثر كربوهيدرات محسوب مي شود كه غلظت آن در القاي گياهان گرده اي نقش بسيار با اهميتي برعهده دارد. غلظت ساكارز در پينه زايي از بساك برنج و باززايي آن 5 - 2 درصد است.